Sejarah
Sebelum
pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melaksanakan immunoassay adalah radioimmunoassay ,
teknik menggunakan radioaktif antigen atau
antibodi berlabel. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal,
yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam
sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow
dan Salomo Berson
diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked
tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk
deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena
radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih
aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan
mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti
peroksidase ) bereaksi
dengan substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ',
5,5'-tetramethylbenzidine ), perubahan warna terjadi, yang digunakan
sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan
antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodi
yang sesuai. Proses menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis
Avrameas dan GB Pierce. [6] Karena itu perlu untuk menghilangkan
antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap
ke permukaan wadah; yaitu immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah
teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada
tahun 1966. [7]
Pada
tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia,
dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang
disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.
ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay)atau
'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan ujiserologisyangumum digunakan
di berbagai laboratoriumimunologi. Uji ini memiliki
beberapakeunggulan seperti teknik pengerjaan
yang relatif sederhana, ekonomis, danmemiliki sensitivitas yang cukup
tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall
untuk menganalisis adanya interaksiantigen denganantibodidi dalam suatu sampel dengan menggunakanenzimsebagai pelapor (reporter label)
(Lequin, 2005).
Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat sensitif, penggunaannya sangay luas,
memerlukan peralatan yang sedikit, reagen yangdiperlukan
sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah didapat.Tes ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antigen
maupun antibodiPemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi
antibodi dalam tubuhmanusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam
pemeriksaan ELISA.
Metode ELISA (enzym-linked
immunosorbent assay)
Metode dalam penelitian dengan
Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag) – antibody(Ab) terdiri dari :
1. Teknik Qualitatif : Tiap berikatan
pada Ag spesifik
2. Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Macam sistem metode yang digunakan dalam elisa :
- Direct
- Indirect
- Sandwich
- Capture
METODE
PEMERIKSAAN ELISA
ELISA diperkenalkan
pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya
interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel
dengan menggunakan enzim sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu
permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya.
Antibodi
ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi
yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA
fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan
pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan
ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada
suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik
yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui
penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama,
disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi
ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.
Antibodi
pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara
langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang
kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian
terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang
visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA
yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitive.
Prinsip metode ELISA
mereaksikan
antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada substrat ( zat yang
digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan. Pada ELISA,
hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat yang disebut
Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil reaksi berupa pendaran cahaya yang
terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence hasil reaksi berupa
pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.
Jenis
Pemeriksaan ELISA
Langkah-langkah "tidak
langsung" ELISA mengikuti mekanisme di bawah ini: -
- Sebuah solusi buffer dari
antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap sumur dari lempeng mikro
, di mana ia diberi waktu untuk mematuhi plastik melalui interaksi biaya.
- Sebuah solusi non-protein bereaksi,
seperti bovine serum albumin
atau kasein , ditambahkan
untuk memblokir setiap permukaan
plastik di sumur yang masih dilapisi oleh antigen.
- Selanjutnya antibodi primer
ditambahkan, yang mengikat secara khusus terhadap antigen lapisan tes yang
baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam serum donor akan diuji untuk
reaktivitas terhadap antigen.
- Setelah itu, sebuah antibodi sekunder
yang ditambahkan, yang akan mengikat antibodi primer.. Antibodi sekunder
ini sering memiliki enzim yang melekat padanya, yang memiliki efek yang
dapat diabaikan pada sifat pengikatan antibodi.
- Sebuah substrat untuk enzim ini
kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan warna substrat ini pada reaksi
dengan enzim. Perubahan warna menunjukkan bahwa antibodi sekunder
telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan bahwa donor
memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen uji. Hal ini dapat membantu
dalam pengaturan klinis, dan dalam R & D.
- Semakin tinggi konsentrasi
antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin kuat perubahan warna.
Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan nilai kuantitatif untuk
kekuatan warna.
Enzim
bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit enzyme-linked tetap
terikat antibodi, molekul enzim akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam
keterbatasan akal sehat, enzim dapat terus menghasilkan warna tanpa batas
waktu, tetapi yang lebih utama antibodi hadir dalam serum antibodi donor lebih
sekunder + enzim akan mengikat, dan warna lebih cepat akan berkembang..
Kelemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bahwa metode imobilisasi
antigen non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes, semua
protein dalam sampel bisa tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik,
konsentrasi begitu kecil analit dalam serum harus bersaing dengan protein serum
lainnya ketika mengikat ke permukaan baik. Sandwich atau langsung ELISA
memberikan solusi untuk masalah ini, dengan menggunakan "menangkap"
antibodi spesifik untuk antigen tes untuk menariknya keluar dari campuran
molekul serum itu.
ELISA
dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif
memberikan hasil positif atau negatif sederhana (ya atau tidak) untuk sampel.
Cutoff antara positif dan negatif ditentukan oleh analis dan mungkin statistik.
Dua atau tiga kali standar deviasi (kesalahan yang melekat dalam tes)
sering digunakan untuk membedakan positif dari sampel negatif. Dalam
kuantitatif ELISA, densitas optik (OD) dari sampel dibandingkan dengan kurva
standar, yang biasanya pengenceran serial solusi dikenal-konsentrasi dari
molekul target. Sebagai contoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan OD 1,0,
titik pada kurva standar yang memberi OD = 1,0 harus dari konsentrasi analit
yang sama sebagai sampel Anda.
Gambar
untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk
enzim, meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi
primer adalah konjugasi enzim. Namun, penggunaan konjugasi antibodi
sekunder-menghindari proses yang mahal untuk menciptakan enzim-linked antibodi
untuk setiap antigen yang satu mungkin ingin mendeteksi. Dengan menggunakan
antibodi enzyme-linked yang mengikat wilayah Fc dari antibodi lain, antibodi
ini enzyme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai situasi. Tanpa
lapisan pertama antibodi "menangkap", setiap protein dalam sampel (termasuk
protein serum) dapat menyerap kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah
antigen amobil. Penggunaan antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan
antigen ke plastik menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan antigen dari
campuran yang rumit sebelum pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan
spesifisitas dan sensitivitas pengujian tersebut.
DAFTAR
PUSTAKA
·
